底物多泛素化驱动无数细胞过程，包括细胞周期、细胞凋亡和免疫反应。多泛素化是高度动态的，到目前为止，需要人工捕获结构来稳定酶促过程中的特定步骤才能获得机制。到目前为止，泛素连接酶是如何构建一个蛋白酶体降解信号的，这通常被认为是四种或更多的泛素，仍然不清楚。在这里，我们展示了在底物多泛素化过程中，被称为后期促进复合物/环体(APC/C)的1.2 MDa E3泛素连接酶及其E2辅酶(UBE2C/UBCH10和UBE2S)的时间分辨率低温电镜研究。利用基于神经网络的cryoDRGN (Deep Reconstructing Generative Networks)方法，我们重建了人类APC/C在多泛素化过程中所经历的构象变化，直接可视化活性E3-E2对修饰其底物，并确定了多种泛素与APC/C部分机制(包括其共激活因子CDH1)之间的意外相互作用。总之，我们展示了用新生泛素链修饰底物如何有助于增强过程中的底物多泛素化，使我们能够模拟泛素连接酶如何构建蛋白酶体降解信号。
分子机器的处理能力对无数的生物过程至关重要，这些过程使生命得以存在。分子机器，如聚合酶、核糖体或蛋白酶体，通常使用核苷酸定向马达来增强过程反应的关键步骤，例如底物的易位1,2。低温电子显微镜(cryo-EM)的最新进展已经能够描述这些机器的物理性质3,4。到目前为止，构象似乎是玻尔兹曼分布的，没有大的热力学障碍，分子可以对整个空间进行采样，这意味着每个构象步骤的微观可逆性5。方向性来自于稳定特定构象状态的过程中的动力学不对称，例如，核苷酸水解。作为其机制的一部分，最重要的泛素(Ub)连接酶并不直接结合或水解核苷酸，但仍然保持着向前驱动的过程活性7,8,9,10,11,12。在多泛素化过程中，超过600个Ub连接酶的完整构象尚不清楚13。因此，我们目前对这些酶如何保持加工性并确保泛素化以定向方式进行的理解是不完整的。
底物泛素化需要Ub通过E1, E2和E3酶级联传递14。E3酶作为底物识别的枢纽，并直接介导Ub从E2到底物的转移。一个关键的Ub连接酶被称为后期促进复合物/环体(APC/C)，它通过识别重要的底物来驱动细胞周期，例如周期蛋白B和安全蛋白，并使它们泛素化以标记它们的蛋白酶体降解16,17。这些底物的降解控制着细胞周期的定时，包括有丝分裂和G1维持18,19。APC/C衬底降解时间的关键决定因素是衬底上Ub信号形成的效率，以及它是以渐进还是分布的方式发生8,9,11,20。这种Ub信号可以通过修饰底物上的许多赖氨酸或通过不同的Ub键(例如，K11、K48、K63或K11/K48支链)而变化21,22,23。在过程泛素化周期中，底物结合APC/C共激活因子(有丝分裂中的CDC20和间期中的CDH1)和APC10(参考文献)。8日,24日,25)。辅激活剂的结合引起cullin-RING (CRL)亚基APC2-APC11的构象变化，从而促进第一个E2 UBE2C/UBCH10的结合，从而将Ub直接添加到底物(图1a)26,27,28。UBE2C可以继续修饰底物赖氨酸或形成短链21,29,30,31。第二个E2, UBE2S，扩展了k11连接的Ub链上的亚基32,33,34。这些反应都可以在单一的底物结合事件中发生，而E2s需要多轮的瞬时结合和催化来修饰底物。
图1:TR-EM显示APC/ C-CDH1-UBE2C-UBE2S结构CTP在底物泛素化过程中。
a, APC/C泛素化底物时反应周期的卡通表示。辅激活子结合促进了从“CRL (cullin-RING)向下”非活性构象到“CRL向上”活性构象的转变。靶底物上泛素化的起始是通过APC2 WHB(翼螺旋B)和APC11 RING结构域募集UBE2C~Ub。UBE2S延长了由UBE2C发起的链。b, TR-EM方法概述。两种含有反应成分的混合物在室温下孵育(1)。混合后开始反应(2)。在指定的时间点从反应中提取样品，并将其应用于网格(3)，然后将其冷冻(4)并使用冷冻电镜成像。在栅格冻结以进行SDS-PAGE(5)时采集代表性样品，如图c. c所示。在栅格冻结的每个时间点，SDS-PAGE凝胶的荧光监测显示APC/CCDH1-E2 (UBE2C或UBE2C和UBE2S)依赖性底物修饰。至少重复3次实验以优化条件。未裁剪的凝胶图像在源数据中可用。d，过滤后的APC/ C-CDH1-UBE2C-UBE2S数据集的颗粒在3.5 ?上的3D重建，显示了组装的活性催化结构。关键亚基和泛素化成分的原子模型符合低温电镜密度，包括CDH1结合到APC/C支架(i和ii)， UBE2C被APC2 WHB和APC11 RING结构域夹住(iii)， UBE2S CTP结合到APC2(绿色)和APC4(浅粉色)形成的凹槽(iv)。
源数据
蛋白酶体降解信号通常被认为是用四个或更多Ubs35修饰的底物。这种信号的E3建筑结构仍然难以捉摸。到目前为止，APC/C与UBE2C或UBE2S的结构，以及其他E3-E2对，主要依靠化学交联方法将动态酶锁定在原位23,27,36,37,38,39,40。这些研究允许对活性催化结构进行高分辨率的结构测定，但限制了我们对e3介导的多泛素化的构象景观和驱动力的理解。对APC/ c依赖性多泛素化的单分子研究表明，底物连接的Ub(s)通过提高底物结合亲和力或过程亲和性扩增来增强泛素化反应的进程性7。然而，对于Ub结合位点、E2结合以及APC/C或任何E3转移Ub以构建蛋白酶体降解信号的精确协调，目前仍未得到详细描述。
在本文中，我们通过时间分辨低温电镜(TR-EM)实验来观察APC/C的作用，并了解其在底物多泛素化过程中的结构和生物物理特性。通过将TR-EM与体外泛素化测定和全内反射荧光(TIRF)显微镜相结合，我们的工作为塑造能量景观提供了框架，在APC/ c依赖性多泛素化的反应路径中没有观察到特别低能量(高密度)的中间体。一般来说，APC/C等大分子机器通过随机结合E2s在柔性结构域内协调动态平衡来实现其活性。因此，这些类型的分子系统表现出高度的多模态异质性。我们表明，APC/C将其柔性畴的热噪声功率与瞬态稳定相互作用以及与新兴的ub修饰衬底耦合以驱动处理能力。共激活剂结合时的变构变化和链延长E2 UBE2S增强了这一过程。总之，这些相互作用使我们能够创建APC/C如何构建蛋白酶体降解信号的模型。
APC/C及其E2s可以进行大量不同的泛素化反应21、22、23、29、30、31、32、33、34、41。捕获这些单独的结构状态需要详细的系统生化知识来稳定反应中间体23,27,36,37,38,42。考虑到多种底物和Ub赖氨酸靶点，需要人工捕获的潜在泛素化状态的数量是巨大的。此外，生成底物泛素化后期的结构以帮助定义加工性的决定因素将需要复杂的蛋白质工程来形成不同的Ub链连接类型。因此，我们试图解决APC/C及其E2s在一段时间内执行多泛素化的结构，以检查其构象异质性，确定未知的多泛素化状态，并揭示底物连接的Ub与APC/C机制之间的相互作用。
为了在底物泛素化过程中生成APC/C的TR-EM样品，我们预孵育了两种混合物，一种含有APC/C、CDH1和底物，另一种含有E1、UBE2C、Mg-ATP和Ub(图1b)。对于底物，荧光标记的含有融合Ub的CycB n端(Ub- cycbn *)被用来确保额外观察到的相互作用是由多泛素化的形成而不是最初的底物启动步骤引起的(扩展数据图1a)。为了研究UBE2S对APC/CCDH1结构景观的影响，我们进行了包含UBE2C和UBE2S的第二次反应。将两种混合物混合以开始反应，并在特定时间点(0.5,1.5,5和15分钟)从反应中提取样品，应用于网格并插入冷冻。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上的可视化反应显示了两个时间过程之间的预期差异，两种E2s的存在导致比单独的UBE2C更长的Ub链(图1c)。两种反应在反应的初始阶段和后期阶段都显示出Ub修饰水平的差异。然后在每个时间点从每个网格收集单粒子电子显微镜(EM)数据(扩展数据图1b)。
在Titan Krios上收集的数据显示，含有APC/ ccdh1 - ub - cycn - ube2c和APC/ ccdh1 - ub - cycn - ube2c - ube2s的反应混合物分别产生了25,380和25,900个薄膜(扩展数据图1b,c)。经过多轮分类，将每个数据集过滤到~ 600,000-700,000个粒子，我们能够为每个数据集解决高分辨率共识结构(3-4 ?)(扩展数据图1d - f和表1)。由于之前的工作，我们能够为两个数据集构建APC/C与其协同激活器CDH1和UBE2C相互作用的结构(图1d和扩展数据图1f)。共激活子N端和c端尾巴也分别在各自的结合位点上被分解，CDH1的IR尾巴定位在APC3上，CDH1的C-box结合在APC8上(图1d、i和ii)(文献27)。CycB的D-box与CDH1-APC10凹槽结合，UBE2C由APC11 RING和APC2 WHB卡扣(图1d, iii)。23日,27日,38)。然而，这两种结构(图1d和扩展数据图1f)与之前工作的关键区别在于，UBE2C不是通过化学交联或通过遗传融合到APC11或UBE2S c端来人为捕获的23,27,38。UBE2S c端肽(CTP)的密度在包含两个E2s的数据集中由APC2-APC4形成的凹槽中可见(图1d, iv)。23日,27)。因此，我们的结构验证了先前依赖于UBE2C和UBE2S化学交联的工作，并揭示了一个E3-E2-E2复合物的结构，该复合物积极泛素化底物，表明这两个E2s可以同时结合APC/C 23,27,38。
将本研究的APC/ C-CDH1-UBE2C的结构与之前两项研究(EMD-2925和EMD-2929)的相同复合体的结构进行比较时，发现结构相似，map-to-map相关性为0.76或0.81(扩展数据图1g)23,27,38。当我们比较本研究中两个数据集生成的APC/ C-CDH1-UBE2C和APC/ C-CDH1-UBE2C - ube2s的结构时，我们观察到图对图的相关性为0.93(扩展数据图1)。换句话说，含有UBE2S的反应并没有显示出UBE2S催化核心的额外密度。在我们的APC/ C-CDH1-UBE2C-UBE2S结构中观察到的UBE2SCTP密度与先前研究中解决的结构一致(扩展数据图1i)。最终，这与之前的动力学研究一致，表明UBE2SCTP提供了UBE2S与APC/C结合的亲和力，这表明E2和E3相互作用之间的内在动力学差异(开断率)是解决E3 - E2对活性泛素化亚策略的潜在限制因素23,27,42,43。这些差异可能是由于结合相互作用或泛素化发生的类型，即泛素化目标直接与构建多泛素链。
为了进一步了解APC/C及其E2s的构象景观，并了解多泛素化过程，我们使用cryoDRGN (Deep Reconstructing Generative Networks)在两个数据集中研究了APC/C在催化过程中的结构异质性。cryoDRGN方法学习将粒子图像映射到低维连续向量空间(称为潜空间)，以及相关的神经网络体积表示，该神经网络体积表示可以从该潜空间中的任何点重建3D密度体积，从而允许可视化每个粒子的唯一3D地图(扩展数据图2a)。完整数据集的潜在空间表示可以使用降维技术，如主成分分析(PCA)和均匀流形近似和投影(UMAP)44在2D中可视化。基于潜在空间表示的k-means聚类可以进一步分析结构的分布，并根据粒子的聚类分配将其划分为不同的状态。对于两个时间过程中的每一个，所有时间点上的粒子都被组合起来用于训练神经网络。UMAP可视化的两个时间过程的潜在空间显示了一个连续的、无特征的表面，表明在不同时间点的结构分布之间存在高度重叠的错综复杂的景观(扩展数据图2b,c)。从k-means聚类中心(k=500)的潜在空间中对500个结构进行了全面采样，结果显示数据集之间的成分和构象变化非常相似，并概括了几种已知的APC/C构象(扩展数据图2b, C)。
沿潜空间主分量产生的轨迹捕捉了APC/C的广泛构象变化。例如，沿着第一个分量(PC1)的轨迹显示了APC2 CRL域(APC2的c端)从“CRL向下”构象过渡到“CRL向上”构象的连续运动(图2a)。沿着第二个分量(PC2)， APC2 CRL可以可视化地从中间部分凸起的“CRL向上”构象过渡到完全凸起的“CRL向上”构象，具有UBE2C的清晰密度(扩展数据图2d和补充视频1)。
图2:Reco函数的构造部分公司低温drgn介导APC/ c - cdh1多泛素化的信息图谱
a，潜在空间中粒子分布的PCA表示，解释方差(EV)在括号中注明。第一个组件捕获APC/C在“CRL向下”到“CRL向上”转换中经历的连续构象变化。APC2、APC11和CDH1的密度分别在指示点以绿色、蓝色和紫色表示。b，对每组主要状态粒子进行均匀三维细化生成的3D模型。密度图通过接近使用刚体拟合建模的亚单元来着色。c,d，左:使用k-means (k=500)聚类对潜在空间中粒子分布的UMAP表示，然后将APC/ CCDH1-UBE2C (c)和APC/ CCDH1-UBE2C - ube2s (d)数据集中存在的四种主要APC/ c状态进行分类。点表示生成卷的簇中心。右图:由主要状态分开的粒子分布的子图。每个类的粒子分布是由它们的局部密度覆盖到整个数据集的粒子分布(灰色)来着色的。e,f，顶部:图显示了APC/ CCDH1-UBE2C (e)和APC/ CCDH1-UBE2C - ube2s (f)数据集在主要州的粒子分布。下图:折线图显示了两个数据集中每个主要状态的相对比例随时间的变化。
通过对k-means聚类中心生成的500个卷应用PCA，我们能够发现APC/C构象变化的有趣方面(扩展数据图3)。沿着第一卷PC轨迹，我们可以追踪协激活子的结合以及APC2 CRL域从“下”构象到“上”构象的同时位移，导致~15 ?位移。第二卷PC轨迹遵循cdh1结合状态，其中CRL部分处于“向上”构象，并经历~11 ?位移到“CRL向上”构象。第三和第四个pc映射了共激活剂和催化核心的异质性，CDH1位移分别为~10和~11 ?。共激活剂附近的密度变化以及催化核心组分(CDH1、UBE2C、APC11、APC2CRL和APC10)之间的接触形成和断裂也被可视化，证明了cryoDRGN在复杂非均质性可视化方面的能力。额外的密度，特别是在PC3和PC4中可见的助活化剂和UBE2C附近，表明由于底物和Ub的存在，催化核心存在非均质性。
对500个cryoDRGN体积的系统分析揭示了四种主要构象状态:APC2CRL结构域为“CRL向下”构象的APC/C, APC/CCDH1-“CRL向上”构象，以及位于APC顶部的APC7或APC2CRL - apc11 RING结构域表现出高度可变性的两类状态(分别标记为“部分APC7和“CRL未解析”)(图2b和扩展数据图4)。虽然“部分APC7”和“CRL未解析”状态的生物学相关性目前尚不清楚，但可以注意到这些状态之间的一些差异。例如，无法解析APC2-APC11的类都包含CDH1。此外，在共激活子周围观察到额外的密度，并且APC2 n端结构域仍然清晰地分解，这表明APC2 - apc11结构域内的动态潜力未被我们的方法捕获。
将四种主要状态映射到潜在空间中粒子分布的UMAP可视化上，揭示了一种复杂的景观，状态之间存在一定程度的重叠(图2c,d)。有趣的是，在两个数据集的景观中都保留了状态相对分布的映射。在两个数据集之间，仅含有UBE2C的数据集显示出较高的“部分APC7”和“CRL未解决”状态的颗粒比例，这表明UBE2S在稳定这些结构域或整体APC/C方面具有潜在作用(图2e,f)。两个数据集都显示出相似水平的“CRL down”粒子。总的来说，在不同的时间点上，状态内的粒子分布变化相对较小，这表明在给定的时间内，无论整体底物泛素化程度如何，混合物中在任何可能的构象状态下都存在新的高密度APC/C中间体(G < 2 kBT)的能量景观空白。这一观察结果表明，多泛素化不是一个具有大能量势垒的过程，相反，反应是随机的，由于多种组分同时结合驱动构象状态，因此存在热噪声和变构。因此，反应过程中的方向性需要用不同于能量势垒的方法来引入。
进一步的k-means聚类主要态体积分析揭示了APC/C构象动力学的附加特征。“CRL down”的主要状态簇可以细分为两个子状态:apo状态在APC10附近没有密度，这可能归因于CDH1;少数簇确实显示密度与CDH1结合一致(图3a和扩展数据图5a)。在apo“CDH1未绑定”状态下，更高水平的“CRL down”与先前的数据一致，数据显示共激活子绑定介导了从“CRL down”到“CRL up”状态的转换26,28。对于“CRL up”状态，我们期望通过结合产生的变构是一种导向力，我们检查了这些状态的组成是否会因UBE2S的存在而改变，如前所述45。当UBE2S存在时，UBE2S结合分数在每个时间点略有增加(图3b和扩展数据图5b)。在不含UBE2S的反应中，UBE2C的存在率约为40%。当加入UBE2S时，随着时间的推移，约50-60%的颗粒中存在UBE2C。这一发现表明，UBE2S改善了UBE2C与APC/C的关联，并增强了多泛素化。
图3:UBE2S CTP增强了APC/C的“CRL up”状态，增加了UBE2C~Ub与APC/C - cdh1的关联。
a,b，从500个采样的cryoDRGN体积中分配的APC/C“CRL up”和“CRL down”主要状态中的子态的量化。“CRL down”簇划分为大多数不存在CDH1的粒子(约80%)。“CRL向上”颗粒包含一小部分颗粒，其中CRL仅部分处于“向上”位置(a)。与不存在UBE2S相比，UBE2S的添加增加了簇中存在的具有归因于UBE2C密度的颗粒的相对数量(b)。c, TIRF显微镜底物固定化和泛素化反应组分定位示意图。alexa488标记的CycBN通过n端生物素化的Avitag固定在中性细胞功能化的载玻片上(使用488nm激光捕获;衬底通道)。APC/ C-CDH1将定位到底物上，随后招募荧光UBE2C-JF549(使用561 nm激光捕获;UBE2C通道)和结合APC2/APC4沟槽的UBE2SCTP肽。因此，UBE2C通道中结合事件的数量与UBE2C定位到APC/ c - cdh1底物相关。d、滴定UBE2SCTP增加了定位于载玻片表面底物的APC/ C-CDH1对UBE2C的募集。给出了三个独立实验的UBE2C结合事件总数的量化(扩展数据图5f)(代表性影片见补充视频2，单分子结合事件蒙太奇和代表性痕迹见扩展数据图5g,h)。误差条:平均值的标准误差。数据归一化到APC/C-CDH1缺失的对照组。试验比较采用单因素方差分析(*P=0.0176)。
源数据
为了在单分子水平上研究APC/ ccdh1相关e2之间的合作相互作用，我们开发了一个基于TIRF显微镜的系统。简单地说，将荧光标记的生物素化底物(生物素- cycbn *)固定在中性素功能化的流动室中(图3c)。用JaneliaFluor549标记的UBE2C (UBE2C- jf549)与泛素化反应组分(包括未标记的APC/C)混合，然后在数据采集前立即加入流式细胞。这些被标记和标记的试剂在底物泛素化反应中保持了它们的功能(扩展数据图5c)。在流动腔内，APC/CCDH1结合固定化底物，将UBE2C-JF549从溶液中招募到载片表面进行泛素化。因此，载玻片表面的荧光信号事件提供了APC/CCDH1募集UBE2C-JF549的读数。我们观察到来自功能化过程的最小背景荧光，来自固定化生物素- cycbn *的强大信号，以及来自UBE2C通道的荧光底物的最小信号，表明我们的TIRF系统允许底物和载玻片表面E2信号之间的清晰描述(扩展数据图5d-h)。
接下来，我们试图通过滴定UBE2SCTP 18mer肽进入反应来评估UBE2SCTP如何影响UBE2C募集。添加UBE2SCTP大大增加了UBE2C在载片表面定位的总事件，表明UBE2SCTP增强了UBE2C在APC/ ccdh1结合底物上的招募(图3d，扩展数据图5f和补充视频2)。这一结果支持了之前的研究，即UBE2S能够通过其在APC/C45上独特的结合安排刺激UBE2C活性。总之，我们在APC/CCDH1上展示了UBE2C和UBE2SCTP之间的协调，并提出了一个灵活的系统，以单分子分辨率研究底物依赖性相互作用。此外，该系统证实了我们的结构数据，即UBE2S有助于稳定“CRL up”构象，允许UBE2C结合APC/C。
到目前为止，大多数与E2结合的RING E3s结构涉及未修饰的底物，模拟底物引物或单泛素化底物，以模拟单泛素化，多泛素化(针对底物上的多个赖氨酸)，或特定的链延伸(扩展数据图6a)23,27,36,37,38,39,40。由于我们的数据集涉及整个多泛素化过程，我们认为局部分类方法将帮助我们比以往更深入地识别多泛素化过程中的APC/C结构。这种处理导致了对RING e3 - e2依赖性多泛素化的意想不到的见解。
在活性位点周围使用掩膜进行局部分类，导致APC/ c - ube2c介导的多泛素化产生了一组前所未有的结构。除了已知的相互作用外，还确定了多个额外的Ub相互作用。首先，一个Ub结合到ube2c结合位点对面的RING结构域上(图4a，左)。这一发现特别有趣，因为之前的工作依赖于紧密结合的泛素变体(UbV)来观察这种相互作用23。接下来，我们在共激活子处观察到意想不到的密度，与Ub的大小和形状一致，表明存在潜在的Ub结合位点(图4a，中左)。在共激活剂和UBE2C的c端区域之间观察到额外的密度，称为螺旋-螺旋-螺旋(HTH)(图4a，中右)。有趣的是，一组粒子的密度似乎是双ub同时接触辅激活剂和E2(图4a，右)。
图4:活性APC/ c依赖泛素化结构分析揭示了意想不到的Ub结合模式。
a、使用掩模对CDH1、UBE2C和APC2/APC11进行3D分类，生成活性APC/C的结构。离散状态显示Ub与已知的APC11 RING外系物(左)相互作用，并与CDH1(中左)和UBE2C(中右)形成接触。一类粒子还包含两个Ubs同时与助激活剂和UBE2C同时接触的结构(右)。b，噬菌体展示选择与APC/C共激活剂结合的UbV (UbVCDH1)。c, UbVCDH1与UbVCDH1序列比对，差异突出。d，考马西染色SDS-PAGE凝胶显示GST - ubvcdh1与APC/C共激活剂(CDH1和CDC20)结合，但GST - ub在GST下拉后不结合。N=3个独立实验。e，通过免疫印迹检测，添加UbVCDH1可抑制有丝分裂HeLa细胞提取物中APC/C底物Cyclin A、Cyclin B、Geminin和Securin的降解，但不抑制Ub。N=3个独立实验。f，将Hsl1 D-box(而不是Hsl1 KEN-box)附着在UbVCDH1上，增强了其对APC/ c - cdh1 - ube2c介导的底物泛素化的抑制作用，通过SDS-PAGE凝胶的荧光扫描在三个独立的实验中进行了监测。g，左:与UbVCDH1结合的APC/C-CDH1的低温电镜结构(橙色)-Hsl1 D-box(红色)显示UbVCDH1在CDH1 β-螺旋桨上ken -box结合位点附近的定位(紫色)。右:先前发表的APC/C与CDH1和Hsl1 (EMD-2651)结合的冷冻电镜图，用于比较28。未裁剪的凝胶代表n=3独立实验的d-f在源数据中可用。
源数据
由于Ub结合可以调节E2s和E3s的活性，这些潜在的Ub与APC11 RING、UBE2C或CDH1的相互作用可能对APC/ c依赖性泛素化产生未被发现的影响。由于我们之前发现Ub可以与APC11 RING结构域和来自其他E2s的HTH相互作用(参考文献)。23,46)，我们试图检查CDH1上意想不到的ub结合位点的功能。由于紧密结合的ubv在解开Ub系统中几种酶(包括APC11 RING结构域)的调控方面有很大的帮助，我们选择了一个针对APC/C共激活剂CDH1和CDC20的ubv库(图4b)。这一过程揭示了在选择过程中大量富集的UbV(从此称为UbVCDH1)(图4c)。为了验证UbVCDH1以类似于野生型Ub的方式与共激活子相互作用，我们进行了一系列测试。首先，共下拉实验发现，GST-UbVCDH1融合比GST-Ub融合更能结合CDC20和CDH1(图4d)。由于UbVCDH1的结合位点可能靠近KEN-box降解位点，我们预计UbVCDH1可以抑制APC/ c介导的泛素化。与这一假设一致，UbVCDH1抑制HeLaS3细胞有丝分裂提取物中APC/C底物的降解(图4e)。相反，添加UBE2C后，底物降解率不受过量Ub存在与否的影响(扩展数据图6b)。
然后用UbVCDH1作为替代物，测定与UbVCDH1结合的APC/CCDH1的结构。为了优化UbVCDH1的结构研究，我们测试了UbVCDH1是否可以融合到APC/C底物Hsl1的KEN-box或D-box中，以进一步加强其与APC/C的相互作用。正如预期的那样，与单独的UbVCDH1或UbVCDH1- hsl1的KEN-box融合相比，UbVCDH1- hsl1的D-box融合明显抑制APC/ c介导的底物泛素化(图4f和扩展数据图6c)。因此，结合UbVCDH1-Hsl1 D-box的APC/CCDH1进行低温电镜分析。正如预期的那样，Hsl1 D-box结合在APC10和CDH1之间，UbVCDH1结合在KEN-box结合位点附近的CDH1上(图4和扩展数据图6d)。这些数据与泛素化实验一致，表明与单独使用UbVCDH1相比，UbVCDH1 - hsl1的KEN-box融合对APC/ c介导的底物泛素化的抑制作用较弱(图4f和扩展数据图6c)。
随着多个ub结合位点的鉴定，我们想要探索它们对APC/ c依赖性泛素化的贡献。除了UbVCDH1外，另一种UbV(以下称为UbVRING)先前被开发用于结合APC11 RING外源，并用于与UBE2C和UBE2S一起捕获APC/C的结构(参考文献23)。为了具体研究这些ub结合位点如何协同促进泛素化，我们使用这两种ubv特异性地破坏这些ub依赖性相互作用(图5a)。首先，我们进行了单次接触实验，专门研究了两种uvs在底物启动(添加第一个Ub)或过程多泛素化中的不同效果。APC/C、CDH1和荧光标记的底物分别与E1、E2、MgATP、Ub和大量非荧光底物的混合物预孵育(图5b)。因此，只有与APC/C预孵育的底物在单次结合事件中被修饰。正如预期的那样，UbVRING减少了在过程泛素化过程中添加到底物上的Ubs数量，但没有破坏底物的启动(图5c,d和扩展数据图7a)。令人惊讶的是，即使荧光底物与APC/CCDH1预孵育，UbVCDH1也能抑制这两种反应。然后，我们进行了与底物无关的实验，以确定所观察到的抑制是针对底物泛素化还是Ub级联的另一个步骤。UBE2C~Ub的氧酯版本的APC/ c依赖性水解和APC/ c - ube2s合成双Ub都不受UbVCDH1的阻碍(扩展数据图7b,c)。因此，我们在多次翻转实验中测试了几种底物的泛素化，发现所有底物都被UbVCDH1抑制(扩展数据图7d)。为了专门测试这些作用的degron依赖性，我们纯化了Ub-Securin的degron变体。有趣的是，两种ubv的加入都抑制了Ub - securin泛素化，这表明ubv通过添加的Ub阻止底物招募(图5e和扩展数据图7e)。然而，当UBE2C作为E2时，UbVCDH1比UbVRING更能抑制Ub-Securin的KENMut/DMut泛素化，这表明UbVCDH1具有额外的抑制机制。
图5:多个ub结合位点通过APC/C促进过程泛素化背景．
a，卡通模型显示结合cdh1 (UbVCDH1)和结合apc11 (UbVRING)的ubv的结合位点。b、单次实验的工作流程。含有多个赖氨酸或单个赖氨酸(1K)的APC/CCDH1和*CycBN预孵育。将uv添加到混合物中。第二种混合物含有E1、UBE2C、MgATP、过量未标记的Hsl1和Ub或甲基化的Ub (meUb)。混合物结合，导致荧光底物泛素化在一个单一的结合事件。c，与CycBN*和Ub的单次APC/ c - cdh1 - ube2c依赖性多泛素化反应的SDS-PAGE凝胶荧光扫描(上)和定量(下)。虚线框为扩展数据图7a中量化的CycBN* >4 Ubs区域。N=3个独立实验。误差条:平均值的标准误差。d，单次与CycBN*(1K)和meUb进行APC/ c - cdh1 - ube2c依赖性底物引发反应的SDS-PAGE凝胶荧光扫描(上)和定量(下)。N=3个独立实验。误差条:平均值的标准误差。e，使用UBE2C(左)或UBE2S(右)，通过荧光扫描监测APC/ c - cdh1依赖性Ub-Securin及其KEN-和D-box降解突变(Ub-Securin KDmut*)的泛素化反应。N=3个独立实验。f, APC/ C-UBE2C荧光标记*UbVCDH1的泛素化依赖于CDH1和APC2 WHB，通过荧光扫描监测。N=3个独立实验。g、METRIS设置，用于监测APC/C与生物素化底物、Ub -底物或链亲和素涂层表面上的Ub的结合。带有生物素化APC/C的磁珠受到磁场的作用。单个珠子的运动被量化，以确定与相互作用强度相关的滚动参数(RP)。h,i，在含有CycBN或Ub-CycBN (h)或Ub (i)的UbVRING, UbVCDH1或两者同时存在的情况下，APC/C在含有CycBN或Ub-CycBN表面上的RP的散点图。试验比较采用单因素方差分析(****P≤0.0001，***P≤0.001，**P≤0.005，*P≤0.05)。NS，不显著。j、APC/ c - cdh1 - ube2c - ube2s依赖性底物多泛素化示意图。APC/C催化结构和UBE2C~Ub (dUb)的招募受CDH1和UBE2S CTP结合的影响，从而驱动泛素化效率。变构驱动的泛素化过程通过稳定多个底物连接Ubs与CDH1和APC11之间的接触进一步介导。未裁剪的凝胶代表n > 3独立实验的c-f在源数据中可用。
源数据
我们的实验表明UbVCDH1也可以作为受体，接收来自UBE2C的Ub而不是UBE2S。为了支持我们的假设，荧光标记的UbVCDH1 (*UbVCDH1)被APC/ C-UBE2C泛素化。事实上，*UbVCDH1可以以CDH1-和APC2 whb依赖的方式进行修饰(图5f)。这些结果表明，CDH1和RING ub结合位点促进了底物结合，提高了APC/C的加工性。此外，辅激活剂结合的Ub也可以作为UBE2C形成Ub链的受体，但不能作为UBE2S形成Ub链的受体(扩展数据图7f)。
考虑到这些与Ub的相互作用本身可能非常弱，我们转向一种称为机械转导免疫吸附试验(METRIS)的创新技术来检测Ub结合位点在为亚策略提供额外亲和力方面的作用51。METRIS是一种单粒子方法，可以提供相对的，但定量的，具有高统计能力的结合评估。将生物素化的APC/CCDH1涂覆在磁珠上，然后将其添加到CycBN或Ub-CycBN的功能化表面，并施加旋转磁场。珠子滚动的距离表明了蛋白质-蛋白质相互作用的强度，并被标记为滚动参数(RP)(图5)。与CycBN(0.15±0.004)相比，Ub - CycBN的RP(0.21±0.007)显著增加，支持Ub增强底物结合的观点(图5h)。此外，当加入ubv以竞争性地消除这种明显的增加时，只有UbVCDH1将RP大幅降低至0.19±0.007，这仍然高于APC/CCDH1对CycBN的RP(图5h)。为了研究CDH1在促进APC/C与Ub结合中的作用，我们分别在CDH1存在和不存在的情况下进行了实验，并且只在功能化表面使用Ub。正如预期的那样，在APC/C中添加CDH1将APC/C与Ub之间的RP从0.14±0.004提高到0.17±0.006(图5i)。此外，这两种ubv的加入完全消除了RPs的这种改善到背景水平(0.13±0.003)，这表明APC11 RING和CDH1都参与了Ub结合。综上所述，这些发现表明，底物连接的Ubs和共激活剂之间的多模态相互作用，以及APC/C本身，共同稳定了新兴的Ub链，并促进了APC/C修饰底物的加工能力和效率(图5j)。
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为了解释分子机制，来自结构生物学方法的数据，例如x射线晶体学或冷冻电镜，与来自生化或生物物理分析的信息相结合。结构研究提供了化学或热力学稳定机器的静态快照。生化分析只能同时监测机器内一组有限的原子排列。E3 Ub连接酶通过瞬时结合辅因子受到强烈调控，并执行许多任务，包括招募不同的底物，与多个E2s相互作用以及形成不同类型的Ub链。因此，试图将生化分析与结构研究联系起来以理解过程反应仍然具有挑战性。此外，了解驱动力量和解决一个不断发展的关键中间状态，ub修饰的底物在很大程度上仍然难以捉摸。为了解决这个问题，我们进行了APC/C与E2s活性多泛素化底物的TR-EM实验。
我们不是用化学方法将APC/C捕获在一个独特的多泛素化结构中，而是通过人工冷冻在一段时间内检测APC/CCDH1对Ub-CycBN的修饰。利用先进的深度学习方法来分析结构异质性，我们能够生成一个功能构象景观，揭示了一个没有高能填充中间体的能量景观，这表明APC/ c介导的UBE2C或E2s多泛素化没有新的热力学障碍。这些景观是随机的，几乎没有最小值或障碍。相反，我们假设热噪声是主要驱动力，基底、Ub和E2相互作用的变化导致APC/C支架发生微妙的变弹性变化，这些变化难以明确分类。简而言之，APC/C有一种可以介导多种任务的作用模式，而直接环境中的细微变化，如底物的泛素化状态或E2结合，可以调节其功能。这种类型的景观也可以很容易地通过其他调节器进行调整。由于APC/C受到多种激酶、磷酸酶和抑制剂的严格调控，每种成分在细胞周期的不同阶段可能只会轻微改变构象景观或导致不同的构象途径18,52。虽然任何结构方法都存在固有的方法局限性，例如，冷冻电镜中的空气-水界面，但我们在不同小组以不同方式制备的结构的基础上再现了几种已知状态，为我们的工作流程提供了支持。对类似的E3s进行此类分析的未来工作可以揭示不同的结合伙伴和翻译后修饰(如cullin类化修饰)如何稳定它们的活性状态40,53。
先前对APC/ c依赖性泛素化的单分子研究表明，底物连接的Ubs要么通过过程亲和扩增帮助推动进一步的催化，要么跟踪Ub链7,54。我们的分析在APC11上发现了一个先前发现的ub结合位点，在共激活剂和UBE2C HTH23上发现了两个潜在的ub结合位点。我们推测这些潜在的ub结合位点可以通过增加对APC/C的底物结合亲和力来增强多泛素化的进程，正如我们的METRIS数据所表明的那样。然而，这些ub结合位点在多泛素化过程中可能有额外的作用。例如，与UBE2CHTH结合的Ub也可能变构调节UBE2C活性。ub -辅激活剂的相互作用同样可能有多种含义。首先，由于UbVCDH1可以作为受体，因此辅激活剂可以将UBE2C在短链延伸的特定方向上呈现。或者，可以将Ub结合位点定位为允许底物赖氨酸被UBE2C而不是Ub修饰的方式。这个假设可能很有趣，因为辅激活剂上的ub结合位点靠近底物KEN-box结合位点。由于APC/C共激活因子是细胞调控的一个关键点，并促进APC/C的底物募集，这些额外的ub结合相互作用可能受到反应环境的一系列微小变化的影响，并可能促进APC/C依赖性反应的多泛素化结果的多样性，例如细胞周期进程。综上所述，底物受体上的ub结合位点可能是E3连接酶中反复出现的主题，因为它可能有助于控制多泛素化的程度。
一些已知的相互作用在我们当前的处理中不存在，这表明该数据集中可能存在许多额外的见解。例如，在我们的改进中没有观察到Ub与APC2 WHB的结合。此外，虽然我们在两个数据集中都观察到UBE2C与APC/C结合，但即使UBE2SCTP清晰可见，也从未观察到UBE2S核心。UBE2S核心与APC2结合非常弱，但UBE2SCTP与APC2 - apc4凹槽结合紧密23,27,42。尽管如此，这两个e2都在APC/ ccdh1 - ube2s - ube2s多泛素化数据集中结合。由于底物引物通常被认为是缓慢的步骤，而链伸长相对较快，我们的工作表明，E2s反应和/或结合动力学的内在差异是对不同E2-E3对采用这种方法的限制因素10,12,55。
总之，我们通过一种创新的方法研究了APC/C介导的底物多泛素化，揭示了APC/C介导底物多泛素化的构象景观。APC/C在整个细胞周期中受到调节，可能需要一个雕刻景观来精细地调整其在不同环境中的活动。此外，多泛素化的进程性不是直接通过核苷酸结合和/或水解产生的，而是通过Ub与E3的结合产生的。众所周知，E3连接酶受翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用的调节。因此，由于我们在相对较少的实验中揭示了APC/ c介导的多泛素化的一些基本见解，我们期望该方法将对未来其他e3的研究有用。
如前所述，重组APC/C在High Five昆虫细胞(Thermo Scientific)中表达56。通过亲和层析、离子交换层析和大小排斥层析(SEC)对APC4 C端带有Twin-Strep(II)-标签的APC/C进行纯化。CDH1、UBE2C、UBE2S、UBA1、Ub、甲基化Ub、Ub - CycB、Ub - Securin、Securin和CycB按照描述纯化42。在酶分析中，CDH1和CDC20分别在杆状病毒感染的昆虫细胞中用n端Myc(3x)-Hexahistidine标签和Flag(3x)标签表达。然后分别对CDH1和CDC20进行Ni-NTA或anti-Flag M2树脂处理，用HRV 3C蛋白酶去除n端标签。通过离子交换层析和SEC进一步纯化蛋白质。为了展示噬菌体，使用不可切割的Myc(3x)-Hexahistidine标签纯化CDH1和CDC20。采用gst亲和层析和SEC对GST-UbVCDH1和GST-Ub进行共下拉实验的纯化。通过sortase依赖反应将荧光UbVCDH1与LPETGG荧光肽偶联，并通过缓冲交换、Ni-NTA树脂和凝胶过滤去除分选酶和未偶联肽进行纯化。UbVCDH1-Hsl1-degron融合体设计包含Hsl1 D-box (HHHHHHENLYFQSGGGMQIFVKTRKGTSITLEVEPSDTIENVK)
akiqdkegippdqqrrfagkqledgrtlsdynihnasslylrsplralagsgsgsssyleeqkpkraalsditnsfnkkkktsitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrlrfagkqledgrtlsdynihnasslylrsplralag)或Hsl1 KEN-box (hhhhhhenlyfqsgggrlrisgvstnnkkpkraalsditnsfnkkktsitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrlrfagkqledgrtlsdynihnasslylrsplralag)。UbVCDH1-Hsl1 D-box和UbVCDH1-Hsl1 KEN-box分别采用镍亲和层析和SEC纯化。
生成GST-TEV-AviTag-Cyclin B (1-88) -Cys - 6xHis或GST-TEV-AviTag-Ub-Cyclin B (1-88) -Cys - 6xHis构建物作为底物固定化用于TIRF显微镜或METRIS。一旦纯化，底物被生物素化，并用alexa488 -马来酰亚胺在c端半胱氨酸上进行荧光标记。
UBE2C-LPETGG-6xHis构建体在BL21 (DE3) RIL大肠杆菌中表达并纯化。UBE2C通过排序酶依赖反应与聚乙二醇修饰肽(GGGG-PEG-k (N3)NH2)偶联并再纯化。通过点击化学，将50 μM的UBE2C与250 μM CuSO4、1.25 mM THPTA和2.5倍过量功能化的JF549染料在冰上反应1.5 h，用JF549荧光标记UBE2C - lpetgg - peg - k(N3)NH2。反应用5 mM乙二胺四乙酸淬火，用SEC纯化。
JF549 CO2H (Tocris, 5 mg, 0.0088 mmol)与Alkyne-PEG-2NH2 (2.52 mg, 0.0176 mmol)在500μl二甲基甲酰胺中，二异丙基碳二亚胺(1.633μl, 0.0106 mmol)、n -羟基琥珀酰亚胺(1.52 mg, 0.0132 mmol)和二异丙基乙胺(4.59μl, 0.026 mmol)存在下反应(补充图1)。室温搅拌过夜。jf549 -炔采用0 ~ 100% a:B线性梯度(a: 95% H2O:5% CH3CN + 0.1%三氟乙酸;B: 95% CH3CN:5% H2O + 0.1%三氟乙酸)。溶剂通过旋转蒸发除去，并在高真空下进一步干燥。收率:4.02 mg, 0.0069 mmol, 78.8%。在400mhz谱仪上记录核磁共振(NMR)光谱。核磁共振(400 MHz, CDCl3):δ2.40 (t, 4 j=2.0赫兹,1 h,炔基CH), 2.54 (qt、3 j=7.6赫兹,4 h, azetidinyl b-CH2), 3.60 - -3.66 (m, 8 h, -OCH2CH2OCH2CH2NH -), 4.12 (d, 4 j=2.4赫兹,2 h,丙炔CH2), 4.22 (t, 3 j=7.6赫兹,8 h, azetidinyl一个CH2), 6.28 (d, 4 j=2.0赫兹,2 h), 6.34 (j - 1=9.2赫兹的dd, 3、4 j2=2.0赫兹,2 h), 6.95 (d、3 j=9.2赫兹,2 h), 7.64 (br t, 3 j=4.8赫兹,1 h, CONH -), 7.72(年代,1 h), 8.00 (d、3 j=8.4赫兹,1 h), 8.24 (d、3 j=8.4赫兹,1 h)。精确质量580.24421米/z。观测质量为580.24484 m/z。
时间分辨的EM反应组分分别以0.7μM APC/C、0.7μM CDH1、1.25μM Ub - cycbn * (mix 1)和2.5μM UBE2C、±2.5μM UBE2S、0.2μM E1、16μM Ub和5 mM Mg-ATP (mix 2)两种浓度组合。混合物1和2在室温下孵育5min，然后组合开始反应。在0.5 s、1.5 min、5 min和15 min采集样品，将样品涂于量箔(1.2/1.3)400 Cu网网格上，使用徕卡冷冻机进行染色，并在液态乙烷中冷冻。在冷冻时取样品进行SDS-PAGE，并使用台风荧光扫描仪进行可视化。
0.7μM APC/C与1.5μM CDH1、90μM UbVCDH1-Hsl1 D-box、0.005%氟化辛基麦芽糖苷共孵育，制备APC/C - CDH1 - UbVCDH1-Hsl1 D-box配合物。将混合物涂在一个量箔(1.2/1.3)200 Cu网格上，用徕卡冷冻机浸泡2 s，然后浸泡在液态乙烷中。
这些网格是用K2探测器上的泰坦Krios(马克斯-普朗克多学科科学研究所)成像的。图像的标称放大倍率为180,000×，像素大小为每像素0.82 ?。图像包含39帧，总剂量为42 e - 2。APC/ C-CDH1-UBE2C数据集共收集显微图25,380张，APC/ C-CDH1-UBE2C - ube2s数据集共收集显微图25,900张(扩展数据图1b)。
EM样品含有APC/ C-CDH1-UbVCDH1-Hsl1 D-box，使用带有冷场发射枪的Titan Krios G4(维也纳)和具有10 V狭缝宽度的柱后Selectris能量滤波器(ThermoFisher)和Falcon 4i直接电子探测器(ThermoFisher)进行成像。采集图像的倍率为18万倍，像素尺寸为0.951 ? /像素，累积总剂量为40 e?2。
使用relion57,58中的MotionCorr2对两个数据集的图像进行运动校正。对比传递函数(CTF)校正在CryoSPARC使用CTFFIND4(参考文献)。59岁,60岁,61)。在CryoSPARC中进行二维分类，分三轮迭代，以过滤掉污染和不良颗粒。结果表明，APC/ C-CDH1-UBE2C数据集中有661289个粒子，APC/ C-CDH1-UBE2C - ube2s数据集中有774933个粒子。然后将该初始模型用作CryoSPARC中3D细化的参考，为APC/ C-CDH1-UBE2C数据集生成4.0 ?模型，为APC/ CCDH1-UBE2C-UBE2S数据集生成3.5 ?模型(图1d和扩展数据图1f)。使用CryoSPARC中的局部分辨率估计工具生成两个最终模型的局部分辨率图(扩展数据图1d)。
使用CryoSPARC Live对APC/ C-CDH1-UbVCDH1-Hsl1 D-box数据集的图像进行预处理(斑块运动校正和CTF估计)，在CryoSPARC中进行30轮迭代的二维分类，过滤掉污染和不良颗粒。然后使用3D分类方法选择同时含有CDH1和UbVCDH1-Hsl1 D-box密度的颗粒。在CryoSPARC中对最佳类别的颗粒进行3D细化，生成3.88 ?的模型(图4)。
使用deepEMhancer对3D均匀细化生成的Cryo-EM密度图进行锐化，并使用灵活的拟合工具与现有的APC/C模型进行拟合[62]。APC/ C-CDH1 - ube2c和APC/ C-CDH1 - ube2c - ube2s - ub - cycbn模型的初始原子坐标使用APC/ C-CDH1 (Protein Data Bank (PDB) 7qe7)的低温电镜结构生成。使用UCSF ChimeraX中的拟合地图刚体拟合工具对模型进行拟合，并使用isolde63,64进行细化。使用ColabFold结构预测生成UbVCDH1-Hsl1 D-box的原子坐标65。采用刚体拟合方法拟合APC/C - CDH1 - UbVCDH1-Hsl1 D-box的低温电镜密度图，采用PDB 5a31拟合APC/C和CDH1的骨架以及UbVCDH1-Hsl1 D-box的colabfold生成结构。
对于cryoDRGN分析，每个数据集的粒子在CryoSPARC中被下采样到200像素的盒子大小(2.35 ? /像素)，并与3D细化的CTF参数和姿态一起训练60个epoch的cryoDRGN 8维潜在变量模型。编码器和解码器架构由三个隐藏层和1,024个节点组成。使用Zhong等人3中描述的cryoDRGN分析工具对模型进行分析，以可视化潜在空间并生成代表性体积和轨迹。使用k=500的k- means聚类来分析粒子的潜在嵌入，并使用解码器网络在聚类中心生成体积来采样异质性。使用数据降维技术，如PCA和UMAP，对粒子分布的潜在嵌入进行可视化(扩展数据图2b)。使用cryoDRGN ' analyze_landscape '工具对k-means (k=500)聚类生成的体进行PCA(扩展数据图3a)。k-means聚类分析生成的500卷被手动分配到四个主要状态之一(“CRL down”、“CRL up”、“CRL未解析”和“Partial APC7”)。从这四种主要状态中提取粒子，并在CryoSPARC中使用均匀细化生成三维细化，分别得到分辨率为4.8 ?， 4.1 ?， 4.2 ?和4.3 ?的地图(图2b和扩展数据图4a)。次要状态为“CRL down, CDH1绑定”、“CRL down, CDH1未绑定”、“CRL up, partial”、“CRL up, no UBE2C”和“CRL up, UBE2C绑定”。
清洗玻璃盖(康宁)，通过硅烷化和聚乙二醇化进行功能化，并组装到流室中进行TIRF显微镜实验。所有缓冲液均经过0.22 μm无菌过滤。盖片在1 M KOH中超声30分钟，在200度EtOH中超声30分钟，然后在去离子水中超声20分钟。盖片在MeOH中超声5 min，在93.5% MeOH、5%乙酸和1.5%(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的溶液中震荡12 min，震荡1 min，再在溶液中震荡12 min，然后在去离子水中震荡60 min。用100 mM NaHCO3、500 mM K2SO4、18%丁二酰戊酸酯- peg和0.4%生物素- peg的溶液将对盖片夹在一起，然后在潮湿条件下的黑暗中培养过夜。
玻璃载玻片(Fisher Scientific)用金刚石钻头进行了改良，在载玻片的相对两侧有三对孔。在孔的外面和每一对之间，沿着滑动片的宽度铺上薄条的双面胶带。功能化的盖板用去离子水清洗，晾干并放置在胶带载玻片的顶部，然后用盖板密封胶密封以形成流室。
组装好后，用100 mg ml?1牛血清白蛋白(BSA)在实验缓冲液(20 mM HEPES pH 8和200 mM NaCl，过滤0.22 μm)中孵育30分钟，然后用0.5 mg ml?1中性中性蛋白和100 mg ml?1 BSA混合物孵育5分钟，然后用50 nM Cyclin B-Alexa488和20 mg ml?1 BSA混合物孵育2分钟。每个孵育步骤后都要清洗培养室。
在IX81 Olympus显微镜上进行TIRF显微镜，配备100倍TIRF物镜(UPLAPO100XOHR，数值孔径1.5,Olympus)，四个固态OBIS激光器(相干OBIS: 405 nm, 488nm, 561 nm和647 nm;通过CoherentConnection软件控制)，以及两台用于双色成像的科学互补金属氧化物半导体相机。显微镜使用MicroManager软件66进行控制。
用4mw功率的488 nm激光在流室中拍摄固定基板的初始图像，以验证基板附着并确定后续分析的兴趣区域。在流室中加入反应组分后，使用561 nm、功率为2 mW、曝光时间为200 ms、时间为10 min的激光采集实验胶片。
将APC/C36、67和CDH1 (mix 1)预混，将BSA、UBE2C-JF549和Ub (mix 2)预混。最终的反应混合物为:30 nM pE APC、100 nM CDH1、20 mg ml - 1 BSA、200 nM UBE2C-JF549、5 μM Ub、100 nM UBA1、0.8% d-葡萄糖、5.6 mg ml - 1葡萄糖氧化酶、0.34 mg ml - 1过氧化氢酶、2 mM TROLOX和UBE2S CTP滴定。这些混合物与5 mM ATP-MgCl2混合，并在数据采集前加入流动室。为了验证我们的系统，使用SDS-PAGE在短时间内监测50 nM生物素- cycbn - a488的泛素化(扩展数据图5c)。
针对每种条件，进行一组N=3的实验。ImageJ/FIJI被用来从实验电影中提取一个标准化的兴趣区域。在MATLAB 2023a中，对图像进行背景相减，并使用基于
小波分解的算法分离单个分子68。使用一种完善的算法将长时间的事件跨框架联系起来。我们的分析使用了MATLAB曲线拟合工具箱、图像处理工具箱、显微镜图像浏览器以及统计和机器学习工具箱。对于每种情况，使用GraphPad Prism中的ROUT方法去除异常值(Q=1%)(参考文献70)。每个实验检测到的结合事件相对于无APC/C的情况归一化。
表1 Cryo-EM数据收集、细化和验证统计
指定为“CRL up”主状态的颗粒被提取并导入CryoSPARC进行进一步分析61。使用仅包含APC/C催化核心(CDH1, APC10, UBE2C, APC11和APC2CRL结构域)的掩膜，使用“3D分类Beta”工具将颗粒分为单独的3D类。每个类别的颗粒使用3D均匀细化进一步细化，并使用UCSF ChimeraX的刚体拟合进行拟合。
通常，荧光底物泛素化实验在室温下进行，用含有sds的样品缓冲液淬灭，用SDS-PAGE分离，并使用台风荧光扫描仪可视化。通过混合70 nM APC/C、0.5μM CDH1、5 mM ATP/MgCl2、1μM E1、1μM UBE2C、0.5μM Ub-CycBN *、±30μM UbVCDH1、±Hsl1 D-box、±Hsl1 KEN-box、±UbVCDH1 - Hsl1 D-box或±UbVCDH1 - Hsl1 KEN-box进行泛素化实验，检测底物多泛素化抑制作用。共加入125μM Ub开始反应，15 min后淬灭。首先将两种不同的混合物孵育5分钟，进行单次接触实验:混合1含有APC/ C-CDH1, CycBN*或CycBN*含有单个赖氨酸和±30μM UbVRING或UbVCDH1，混合2含有0.1μM E1, 5μM UBE2C, 5 mM ATP/MgCl2，过量未标记的Hsl1 D-box(48μM)， Ub或甲基-Ub(125μM)。将两种混合物混合，然后在3分钟后淬火。对含有总修饰底物或含有>4个Ubs修饰底物的条带进行量化，并相对于野生型水平进行归一化。使用GraphPad Prism绘制数值。底物泛素化反应检测Ub - securin降解突变体，加入70 nM APC/C、0.5μM CDH1、5 mM ATP/MgCl2、1μM E1、1μM UBE2C、0.5μM Ub - securin *、±30μM UbVCDH1、±30μM UbVRING、125μM Ub启动反应，15 min后猝灭。检测不同E2和底物组合的泛素化实验以类似的方式进行:70 nM APC/C、0.5μM CDC20、5 mM ATP/MgCl2、1μM E1、1μM E2 (UBE2C、UBCH5B和/或UBE2S)、0.5μM底物(CycBN*或Ub-CycBN*、Securin*或Ub-Securin*)和±30μM UbVCDH1。*UbVCDH1泛素化反应采用50 nM APC/C或APC/C?WHB，±0.5μM CDH1, 7μM *UbVCDH1, 2μM UBE2C和/或UBE2S, 1μM E1, 5 mM ATP/MgCl2和125μM Ub，分别在0,30和60 min时间点进行。
在存在和不存在助活化剂或UbVCDH1的情况下，用氧酯连接的UBE2C~Ub(其中~表示氧酯连接)测试了APC/C催化UBE2C水解Ub的内在能力。反应混合物中含有1μM APC/C, 5μM UBE2C~Ub和±10μM UbVCDH1，在室温下淬灭0,3或5 h，用SDS-PAGE和考马西染色进行可视化。Di-Ub合成实验如前所述，加入±10μM UbVCDH1(参考文献)。23)。
UbV库基于与Ernst等人生成的库2相同的设计。噬菌体展示选择按既定方案进行48。简单地说，将1 μM纯化的CDH1和CDC20包被在96孔MaxiSorp板(Thermo Scientific)上，在4°C孵育过夜。利用噬菌体展示的UbV文库对固定蛋白进行了五轮筛选。用PBS- b(添加1% BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS))封住包被的孔，在4℃下孵育1小时。将原始噬菌体展示库(第一轮)或前一轮的富集输入(后续一轮)加入每个包被孔中，室温孵育1小时。用PBS- t (PBS中添加0.05%的吐温-20)清洗包被孔，去除非结合噬菌体。洗涤强度随着每一轮的增加而增加。为了洗脱结合的噬菌体，在每个包被孔中加入0.1 M HCl，在室温下孵育5分钟。加入1 M Tris-HCl (pH为11)中和pH，并将BSA加入洗脱的噬菌体至终浓度为1%。通过将洗脱的噬菌体和辅助噬菌体重复感染大肠杆菌OmniMax，可以扩增洗脱的噬菌体以产生后续轮次的输入噬菌体。在第5轮筛选后，对第4轮和第5轮产生的噬菌体进行噬菌体ELISA分析，获得粗结合数据，并对其对应的噬菌体进行Sanger测序，获得UbV序列，评估结合物富集程度。CDC20的选择产生了本研究中使用的共激活剂结合UbV。
使用检查点(CP)无细胞提取物的降解试验基本上按照前面所述进行45,71。HeLaS3细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco 's modified Eagle培养基(DMEM, Gibco)中，37℃、5% CO2培养。将融合细胞接种于15 cm板中，每板300万个细胞，次日用2 mM胸腺嘧啶处理24 h。除去含胸腺嘧啶的培养基，用温PBS洗涤细胞2次，用无药DMEM洗涤细胞1次，在DMEM中释放4 h。然后，将细胞用100 ng ml?1的nocodazole在DMEM中处理11 h，获得早期有丝分裂(前期)群体，并收集用于提取物制备。有丝分裂细胞(>95%)通过“摇脱”收集，以277g成球，用PBS洗涤一次，然后在1ml冰冷的PBS中重悬，并在Eppendorf管中成球。4 × 15 cm培养皿中的细胞小球在600μl SB缓冲液(20 mM HEPES pH 7.5、1.5 mM MgCl2、1 mM二硫苏糖醇、5 mM KCl、2 μ ml - 1胃抑素、2 μ ml - 1 apoprotein蛋白、10 μ ml - 1胰肽、1 mM 4-(2氨基乙基)苯磺酰氟和1 mM Na3VO4)中裂解，并添加20 μl能量混合物(375 mM磷酸肌酸、50 mM ATP和50 mM MgCl2, pH 8.0)。细胞在冰上孵育30分钟，每5分钟翻转一次，然后在液氮中冷冻，然后在30°C下快速解冻，重复该过程。DNA通过裂解物通过20 1/2 G 7次和25 3/8 G 2次剪切。裂解液先在4℃下3075g离心5min，上清液在4℃下24104g离心30min。所得到的提取物被引用，保存在- 80°C或立即使用。通常情况下，在50 μl CP提取物的主混合物中添加12 μl能量混合物，850 μM Ub或UbVCDH1的12 μl和40 μM UBE2C的3 μl。主混合物在新鲜SB缓冲液中以1:1稀释，不含蛋白酶抑制剂，反应在30°C下孵育。在指定时间取出等分，用样品缓冲液停止，煮沸，用SDS-PAGE和western blot分析。
METRIS实验与先前描述的方法类似51。APC/C在APC4的C端含有一个多用途标签，包括HaloTag、AviTag和Twin-Strep(II)-tag。经过上述离子交换层析，APC/C被生物素化并进行SEC。Ub被生物素马来酰亚胺在n端半胱氨酸上进行生物素化。
加入生物素化的Ub, CycB或Ub-CycB，使其完全饱和并包被链亲和素高容量八孔条带，并使其结合2小时(Sigma-Aldrich)。然后用阻塞缓冲液冲洗孔，静置30分钟后再次冲洗。将生物素化的APC/C添加到链霉亲和素包被铁磁珠(Spherotech)理论容量的50倍以上。生物素- apc /C (3 μM)和CDH1 (15 μM)与铁磁珠孵育2小时，磁珠溶液稀释5000倍后，将磁珠溶液插入孔中，用永久钕磁铁磁化。将井置于类似亥姆霍兹线圈的装置中，旋转磁场以1hz的频率驱动，进行所有实验。数据采集使用相机进行可视化、视频捕捉和后续分析，如前所述51。RP为弹丸运动的距离(?x)除以球体的最大理论位移，计算公式如下:
式中，D为粒子直径，ω为旋转磁场频率，τ为驱动时间。
有关研究设计的更多信息可在本文链接的自然组合报告摘要中获得。
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